عنوان آزمایش: تشخیص و شمارش افتراقی گلبول های سفید

هدف آزمایش: تعیین درصد لكوسیت ها (انواع گلبولهای سفید) در خون

کمبود یا زیادی تعداد هر نوع از گلبول ها می­تواند حاکی از اتفاقاتی در داخل بدن باشد، به عنوان مثال: افزایش درصد ائوزینوفیل ها درخون می تواند دلیلی بر ابتلا فرد به بیماری­ های کرمی یا بیماری­ های حساسیتی و… باشد. افزایش درصد نوتروفیل­ های خون را نوتروفیلی گویند ودر بیماری هائی همچون آپاندیسیت حاد، پنومونی (سینه پهلو)، مننژیت چرکی، سپتیسمی میکروبی، دیفتری، تب های روماتیسمی... نوتروفیلی دیده می­شود. افزایش درصد مونوسیت های خون را مونوسیتوز نامیده می شود و در بیماریهای توبرکولوزیس (بیماری سل)، بروسلوز (بیماری تب مالت)، سیفلیس، تیفوس،مالاریا، عفونت های قارچی و غیره دیده می شود. افزایش در صد لنفوسیت های خون لنفوسیتوز نامیده می­شود و در بیماری­هایی همچون سل، سرخک، اوریون، آبله مرغان، هپاتیت، حصبه، سیفلیس، سیاه سرفه، تب مالت و... دیده می­شود. درخون یک شخص نرمال ممکن است ۵ نوع گلبول سفید یافت شود که به ترتیب نوتروفیل ۶۰ درصد، لنفوسیت ۳۲درصد، مونوسیت ۵درصد، ائوزینوفیل ۳درصد و بازوفیل نزدیک به صفر درصد WBCهای خون را تشکیل میدهند.

برای این آزمایش نیاز به لام گسترش خونی داریم. به همین جهت: در مرحله اول

طرزتهیه گسترش خونی: نمونه خون حاوی ماده ضد انعقاد EDTA را به آرامی خوب مخلوط می­کنیم .یک قطره خون را (به وسیله لوله موئینه)در یک سانتی متری انتهای لامA قرار می دهیم لبه لام دیگر مثلا لامB را با زاویه حدود (۳۰) درجه بر روی قطره خون قرار می­دهیم. لحظه بعد خون سراسر روی لبه لام B یعنی فصل مشترک دولام انتشار می­یابد .اکنون لام B را با همان زاویه (۳۰) درجه با یک فشار ملایم و سرعت یکنواخت در سطح لام A به سمت جلو حرکت می­دهیم.

اکنون گسترش خونی آماده است . لام را می­ گذاریم خون سطح لام خشک شود. سپس در حاشیه گسترس توسط مداد مشکی مشخصات فرد آزمایش شونده را می­نویسیم. خون روی لام را با الکل متانول ثابت میکنیم . حالا گسترش خونی برای رنگ آمیزی آماده است. باید گسترش خونی دوسوم سطح لام را اشغال کند. پس گسترش خونی کوتاه ارزش پائینی دارد چرا که گسترش خونی مطلوب دارای مناطق ضخیم, متوسط, نازک می باشد. انتهای گسترش خونی شعله شمعی باید باشد. انتهای گسترش های خونی ناصاف کج ونوک تیزبی ارزش تلقی می شود.

نکته:یک گسترش خونی نادرست باعث اشکال در تشخیص سلولهای خونی می شود.

خلاصه کار: ثابت کردن یا فیکس کردن گسترش خونی(لام خونی) تهیه شده را می گذاریم خوب خشک شود. لام خونی را روی دهانه یک لیوان قرار میدهیم. روی سطح لام خونی قطره قطره الکل متانول می­ریزیم. بطوریکه الکل تمام سطح لام خونی را فرا گیرد. صبر می کنیم تا الکل روی سطح لام خوب خشک شود. (این عمل را ثابت کردن لام خونی با الکل گویند.)

در مرحله دوم جهت رنگ آمیزی، رنگ گیمسا را به نسبت یک به ده با آب رقیق می­کنیم. (۱ccرنگ گیمسا + ۹ccآب) روی سطح لام خونی که ( ثابت شده است) را با رنگ رقیق شده می­پوشانیم. بعد ازگذشت ۲۰ تا ۳۰ دقیقه رنگ روی لام را دورمی­ریزیم. لام را زیر شیر آب با جریان ملایم گرفته تا رنگ­های اضافی خوب شسته شود. حالا سلول های خونی روی لام رنگ گرفته اند. می­گذاریم لام خشک شود. روی لام یک قطره روغن ایمرسیون می­چکانیم.

تفسیر و نتیجه گیری:

زیر میکروسکوپ با عدسی شیئی لام را مورد مطالعه قرار می دهیم. بعد زیر میکروسکوپ با عدسی شیئی X100یا X40لام را مورد مطالعه قرار می دهیم.

توجه:در تمام مراحل مواظب باشید لام را پشت وارونه نگذاشته باشید.

اجزا و ساختمان­های اسیدی سلولها, رنگ های قلیائی را می­پذیرند لذا این ساختمان­ها را بازوفیلیک(قلیا دوست) یا دوستار مواد بازی گویند , مثل هسته سلول که در این رنگ آمیزی آبی رنگ می­شود. اجزا وساختمان­ هایی که فقط رنگینه ­های اسیدی را به خود راه می­دهند اسیدوفیلیک (اسید دوست) یا ائوزینوفیلیک(ائوزین دوست) می­ نامند. این اجزا که در سیتوپلاسم بعضی سلولها قرار دارند با این رنگ آمیزی قرمز رنگ می­شوند.

توجه:اجزاوساختمان­ هایی که ترکیبی ازدو رنگینه هم رنگینه اسیدی هم رنگینه بازی را به خود راه می­دهند نوتروفیلیک (خنثی دوست ) می­نامند. بهترین رنگ برای رنگ آمیزی گسترش خونی رنگ رایت و رنگ گیسما (رایت+ گیمسا) است رنگ آمیزی گیمسا با توجه مشکلات و عیوبی که برای آن ذکر می­شود هنوز به عنوان رنگ آمیزی روتین ومعمول آزمایشگاه­ ها از آن استفاده می­شود. بعد از تهیه گسترش خونی اگر لام را زیر میکروسکوپ قراردهیم . فقط هاله ای از سلولها ی خون را مشاهده می­کنیم. این رنگ خود حاوی دو رنگینه است: ۱- رنگینه متیلن آبی ۲- رنگینه ائوزین . رنگینه متیلن آبی که خاصیت بازی دارد , قسمتهای اسیدی سلول را رنگ می کند.

توجه:مقصود از قسمت اسیدی هسته سلول است (به خاطر وجود نوکلئیک اسید هسته سلول ها خاصیت اسیدی دارند.) که با این رنگ آمیزی به رنگ آبی تیره متمایل به بنفش در می آید.

دقت: رنگ ائوزین خاصیت اسیدی دارد. دانه های موجود در سیتوپلاسم سلول خاصیت بازی دارند و با ائوزین به رنگ نارنجی درمی­ آیند. به عنوان نمونه دانه های موجود در سلول های ائوزینوفیل که با رنگ آمیزی گیمسا به رنگ نارنجی درمی آیند.